肝细胞癌（简称“肝癌”）是世界上最常见的恶性肿瘤之一，在我国尤为高发，每年新发病例和死亡病例均占全球近一半。手术切除是目前肝癌治疗的首选方式，但70-80%的肝癌病人确诊时已发生肿瘤播散转移，为中晚期肝癌，失去了手术机会；即使手术切除，肝癌术后5年转移复发率高达60-70%。肝癌的转移复发是影响病人长期生存的主要原因，并已成为进一步提高肝癌整体疗效的瓶颈。目前肝癌转移肿瘤的基因突变和分子表达全景图谱仍极度缺乏，肝癌在转移过程中的克隆选择等演化规律尚不清晰，导致肝癌转移病灶的临床诊疗仍然缺乏足够的理论指导。全面深刻认识肝癌转移复发的内在机制，探索更有效的干预新策略，已成为进一步提高肝癌病人总体生存率的关键课题。

2023年12月14日，复旦大学（附属中山医院）肝癌研究所樊嘉院士团队与上海科技大学张力烨团队及上海顿慧医疗合作，于国际顶尖肿瘤学期刊《cancer cell》在线发表了题为 integrated multi-omics profiling to dissect the spatiotemporal evolution of metastatic hepatocellular carcinoma 的研究成果。本研究整合分析多组学数据，在国际上首次系统刻画了肝癌转移的时空演进全景图谱，揭示了肝癌转移的复杂进化轨迹和克隆选择机制，为研发肝癌转移预测的新标志物和治疗新靶点提供了宝贵的数据和理论基础。

该研究从复旦大学附属中山医院和天津肿瘤医院肝癌样本库两万多例肝癌手术病人中筛选出182例肝细胞癌患者，并对原发灶、转移灶和肝内复发灶手术切除样本回顾性多区域取样，最终共收集461个石蜡包埋组织，进行基因组、转录组、单细胞转录组、空间转录组和数字病理等多组学联合测序分析。为肝癌转移异质性研究提供了广泛的时空多组学数据。

为了追踪转移肿瘤的克隆起源，研究者利用snv/indel/cnv等数据，在空间和时间多维度构建了肿瘤克隆演化树。克隆演化结果提示：1、有多个遗传上独立发展原发灶的患者，其中只有最具转移潜力的单个原发肿瘤可发生癌细胞播散从而生成所有转移灶；2、相较独立生成且与原发灶遗传不同的多中心肝内复发灶（multicentric occurrence，mo-rt），与原发灶遗传相似的播散型肝内复发灶（intrahepatic metastasis，im-rt）转移潜力更强；3、同一器官内或不同器官间的各转移灶之间可相互播散。然而，当患者发生多次肝外转移时，后期出现的转移灶往往倾向于由原发肝癌直接播种。

研究团队进一步针对有多区域取样测序结果的转移灶样本，进行转移定植克隆模式的研究，分析发现约3/4的转移肿瘤为单克隆定植，剩下的1/4为多克隆定植。与单克隆转移灶相比，发生多克隆转移的病人疾病进展更快，预后更差，进一步分子机制研究发现缺氧信号通路活化可能是多克隆转移的关键驱动因素。

根据临床肿瘤分期，转移是肿瘤进展的终末事件。然而本研究通过建立生信算法测算了肝癌转移启动的分子时间，发现80%的肝癌转移播散启动于原发灶生长的早期。这一发现提示肝癌手术前新辅助靶免治疗和手术后辅助靶免治疗可有助于及时清除早期播散的微转移肿瘤细胞，进而降低手术后转移复发风险。

经典肿瘤进化理论认为，肿瘤转移过程存在进化瓶颈，即只有少数克隆的肿瘤细胞有能力突破进化压力，形成转移灶，因而普遍认为转移灶的瘤内异质性低于原发灶。然而本研究提示，肝癌转移灶的瘤内异质性与原发灶相当，且高于已报道的结直肠癌和骨肉瘤转移灶的瘤内异质性。进一步对转移肿瘤的新抗原瘤内异质性进行分析，发现新抗原异质性更高的转移灶具有更弱的抗肿瘤t细胞免疫，且病人预后更差。其背后的机制可能是转移肿瘤细胞进化出抗原递呈缺陷的能力，以降低其免疫原性，进而抑制抗肿瘤t细胞免疫的活化。因此如何有效提高肝癌转移病灶的新抗原释放，增强免疫原性，是未来的临床和基础研究中亟需解决的关键科学问题。

研究团队还发现，肝癌转移病灶较原发病灶有更高的基因组不稳定性。通过比较体细胞拷贝数改变在配对原发灶和转移灶之间的克隆选择，筛选出7个在转移灶显著富集的拷贝数改变。接着在原发灶中基于这7个缺失变异计算风险评分，综合多因素分析发现该风险评分可作为原发肝癌手术切除后肝外转移发生的独立预测因素。这些结果提示体细胞拷贝数改变可能是驱动肝癌转移的关键基因事件，有望成为预测肝癌转移的新型生物标志物。

最后，研究者对转移过程中亚克隆驱动突变的进化选择进行了系统地刻画，发现多种癌相关基因的亚克隆突变在转移的克隆选择过程中均被淘汰。值得注意的是，与wnt突变亚克隆相比，wnt野生型亚克隆表现出更强的转移选择优势，这与通常所认为的关键致癌通路-wnt通路驱动转移的预期是相悖的。整合单细胞转录组、空间转录组及多重免疫荧光等手段，发现wnt野生型原发灶微环境“热”且“耗竭”，显著富集各类抑制性免疫细胞和肿瘤相关成纤维细胞，为wnt野生型肝癌细胞向其他器官播散提供外部动力。wnt野生型转移灶同样具有特征性免疫微环境，即富集浸润免疫抑制性b细胞。这群b细胞通过hla-e:cd94-nkg2a免疫检查点轴介导cd8+ t细胞终末耗竭表型增加。这个结果也提示肿瘤亚克隆在原发灶生长竞争以及在转移播散方面的竞争优势不完全一致，肿瘤亚克隆转移播散的优势需要综合考虑到其塑造和利用免疫微环境的能力而非仅仅是肿瘤细胞单兵作战转移能力的高低。

复旦大学附属中山医院樊嘉院士、上海科技大学张力烨研究员、复旦大学附属中山医院孙云帆副研究员及上海顿慧医疗彭海翔博士为本文共同通讯作者，孙云帆副研究员、吴频博士、张泽凡博士、王泽健博士、周恺乾博士、宋敏芳博士、纪元教授、臧凤琳教授为本文共同第一作者。该课题得到了国家自然科学基金、上海市创新集群等项目资助，顿慧医疗和上海科技大学超算中心为多组学数据产出和生物信息分析提供了大力支持。